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2023-09-157290 次浏览
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肿瘤细胞转移主要包括以下5个过程:

原位侵袭(Local invasion)

肿瘤细胞内渗(Intravasation)

循环系统存活(Survival in the circulation)

肿瘤细胞外渗(Extravasation)

形成转移灶(Micrometastasis formation)等。


其中细胞侵袭发生在第一步,即肿瘤细胞在原位突破基底膜,然后内渗进入血管、淋巴管的过程。其侵袭性是肿瘤相关信号通路、药物治疗、靶向治疗、致癌/抑癌基因等肿瘤学研究的一个重要指标。


(肿瘤细胞转移过程,来源DOI:10.1016/j.cell.2011.09.024)


肿瘤细胞侵袭实验通常利用细胞小室(常用6孔、12孔、24孔板等)进行检测。


与肿瘤细胞迁移实验不同的是,需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶,用以模仿细胞外基质。

肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶(MMPs)消化基质才能进入下室,更好的模拟了动物体内的情况。


侵袭实验过程

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a. 基质胶包被:

(a) 将基质胶置于冰中并在4℃融化,使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态。
(b) 在冰上,将基质胶用无血清培养液按照1:8的比例进行稀释,例如取8µl基质胶加入64µl不含血清的培养液中,使用预冷的吸头混合至均匀状态。

注:常用的稀释比例为1:4、1:6、1:8,可根据实验具体情况调整稀释比例。
(c) 取60µL上述混合溶液垂直加入细胞小室中,使其均匀平铺在底部。

(d) 吸出未结合的基质胶。

(e) 加入100µl不含血清的培养液,将培养板置于37℃培养箱孵育30分钟,进行水化。
(f) 去除小室中液体,检查是否有液体穿过小室进入到下室中,若没有,则可用于接种细胞。


b. 细胞悬液的制备:
(a) 对细胞进行12-24小时的饥饿处理。(非必需步骤)
(b) 消化细胞,用不含血清的培养液重悬,调整细胞密度为5-50万个/mL。


c. 细胞接种:
(a) 取500µL含10% FBS的培养液加入24孔板下室,用镊子将细胞小室置于24孔板内。

(b) 取200µL细胞悬液加入细胞小室。
(c) 将24孔板置于培养箱中培养24-48小时。


d. 细胞固定、染色:
(a) 取出细胞小室,去除培养液,用棉签轻轻擦拭基质胶及细胞。
(b) 在24孔板干净的孔中加入600µl 4%多聚甲醛固定液,将小室放入固定20-30分钟。
(c) 弃固定液,PBS洗涤小室1次。

(d) 在24孔板干净的孔中加入适量结晶紫染色液,将小室放入染色5-10分钟。
(e) 取出小室,PBS洗涤3次。

(f) 适当风干后,显微镜下观察并计数。


除细胞侵袭实验外,基质胶可被用于类器官培养、干细胞分化、血管生成、体内肿瘤发生等多项研究。