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2023-07-311287 次浏览
实验 | 细胞增殖检测-软琼脂克隆实验

NEST

实验时刻

软琼脂克隆实验

软琼脂克隆形成又名非锚定依赖性生长实验(Anehorage-independentassay),利用软琼脂为培养介质,使细胞在悬浮状态下生长。

软琼脂克隆形成实验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。

细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量,主要反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

Part 01.

实验材料

细胞培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、琼脂糖、结晶紫
细胞培养板、微量离心管(EP管)、移液吸头、移液枪



Part 02.

实验操作流程

1.提前配置1.2%和0.7%琼脂(Agarose 加蒸馏水配置),高压灭菌后4摄氏度冰箱保存。铺板当天微波炉或烘箱加热融化,置于37摄氏度培养箱中。
2.铺下层胶:按1:1比例混匀1.2%Agarose和20%1640,6孔板每孔取2毫升混合液,在室温条件下等待冷却凝固。
3.取对数生长期细胞,消化配置成单细胞悬液,计数后将细胞数调整为5*10^4/毫升。
4.铺上层胶:按1:1比例使0.7%Agarose和20%1640培养基混匀,取2毫升混合液于EP管中,向管中加入10-20微升细胞悬液,充分混匀后加入已铺下层胶的6孔板中,待上层琼脂凝固后,放在37摄氏度培养箱中培养2-3周,每三天向孔板中加入200微升培养基。
5.显微镜下拍照,统计克隆直径并作图。



常见问题与解答

Q:细胞密度为多少合适?

A:细胞接种密度与最终实验结果密切相关,若细胞太多,形成克隆数目太多,处理结果时数克隆不仅容易出错,而且图片很难看(下图左)。细胞太少,不能形成克隆。如下图所示:

上图我们看到3株癌细胞在6孔板克隆形成图片,第一个明显铺板细胞太密集,导致难以统计数据;中间那个正好,最后面那个细胞数量偏少,且细胞铺板不均匀。因此,为了获得美观的图片和准确的数据,第一次实验最好设置细胞接种梯度,如500-1000-2000-5000个/孔挑选出最合适的接种密度。细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度,否则结果的准确度会受到很大影响;另外注意细胞计数时建议多计数几次。

Q:细胞接种后培养的时间,如何确定?
A:通常情况下,单个细胞在体外增殖6代以上所组成的细胞群称为一个阳性克隆,时间约为一周;但具体时间因细胞增殖能力而已异,因此应密切关注细胞生长情况,隔天在显微镜下观察克隆情况,若单个克隆细胞数到达50个左右即可固定细胞。
Q:细胞铺板均匀的重要性
A:若铺板不均匀,细胞稀的地方形成的克隆少,而密的地方克隆多,一方面影响统计结果,并且拍出的图片不美观。
Q:细胞未形成克隆的原因?

A:并非每种细胞都可以形成克隆,克隆形成率与细胞本身增殖能力有关。还与接种细胞密度,加入培养液的体积、血清浓度有关。因该实验处理时间较长,应给细胞多加培养基,如每孔4ml,或者3天更换一次培养基,以供给细胞充足的营养。


Q:计数时克隆数目较多,有什么快捷办法?
A:只要细胞铺板均匀,我们可以选择分区计数,取平均数。
注意事项
1.细胞一定要吹打分散成单细胞悬液
2.接种时细胞密度不可过高
3.软琼脂与细胞混合时温度不可过高,容易烫伤甚至烫死细胞。
4.软琼脂对热和酸不稳定,反复加热容易降解并产生毒性,且容易造成硬度下降,因此需要高压灭菌后进行分装。
5.铺板操作时速度要快,以免造成局部凝固。


END